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吸光度测量基础知识

紫外-可见光吸光度测量长期以来一直是生命科学实验室中定量纯化生物分子的标准方法。该方法允许根据分子在特定波长下的吸光度曲线快速检测分子。

吸光度还提供样品污染的指示。吸光度光谱的形状将根据其他分子的存在而变化，这些分子的吸收波长与目标分子相同或接近相同波长。

荧光定量基础知识

荧光团是吸收一个波长（激发波长）的光并发射另一个波长（发射波长）的光的分子。某些荧光团的结构只有在与特定分子（例如双链 DNA）结合时才能发出荧光。荧光检测利用这种结合特异性来建立样品发射的荧光量与溶液中目标生物分子浓度之间的直接关联。

通过将荧光基团与已知浓度的样品混合并测量相对荧光单位 （RFU），可以绘制浓度与测得的 RFU 之间的关系，并将其用作标准曲线。然后可以将与未知样品结合的相同荧光团的发射光与该标准曲线作图，以确定样品浓度。

比较吸光度和荧光结果

在比较基于吸光度的方法和基于荧光的方法的结果时，重要的是要考虑每种方法的特异性。例如，在 260 nm 处的吸光度测量对 dsDNA 没有选择性，因为 ssDNA 和 RNA 也在 260 nm 处吸收。在 260 nm 处的任何吸光度测量都是对样品中所有核酸和存在的任何污染物（包括蛋白质）的测量。这适用于所有类型的测量，而不仅仅是核酸。因此，吸光度法非常适合测量纯样品。

相比之下，荧光检测对给定的分析物具有高度特异性，包括但不限于 dsDNA、ssDNA、RNA 或蛋白质。通常，通过吸光度测量的样品浓度大于通过荧光方法测量的浓度。